Exercício Colaborativo "Análisis de INDELs autossómicos para identificação humana" 2102
Desenvolvimento
O
presente exercício compreenderá duas fases. Uma primeira fase em que se
fornecerá aos laboratórios participantes um mix de primers necessário
para realizar a genotipagem das quatro amostras control, para 38 indels
autossómicos. O método de genotipagem das amostras é simples e
semelhante ao realizado para STRs, compreendendo uma única PCR multiplex
seguida de electroforese capilar (Pereira et al., 2009; Pereira & Gusmão, 2012).
A
implementação adequada da técnica e a genotipagem correcta das amostras
desta primeira etapa permitirá ao laboratório o acesso à segunda fase
do exercício. Nesta segunda fase, é recomendado que cada laboratório
caracterize a(s) população(ões) de referência de interesse para
construir uma base de dados genéticos adequada à sua rotina (minímo de
100 amostras de uma população).
Para
realização deste exercício, será fornecida aos laboratórios
participantes uma aliquota do mix de primers suficiente para um número
de 500 reações. Aos laboratórios interessados em caracterizar um número
mais elevado de amostras/populações (para inclusão no presente trabalho)
poderá ser enviada uma aliquota extra de primers, mediante solicitação.
O trabalho de laboratório compreende as seguintes fases:
1. PCR multiplex. Amplificam-se os 38 marcadores numa única reacção de PCR usando o mix de primers fornecido. O mix de primers encontra-se optimizado para se obter produtos de reacção equilibrados seguindo o protocolo indicado. O protocolo original utiliza a master mix de amplificação "QIAGEN Multiplex PCR Kit".2. Separação electroforética dos fragmentos amplificados. A realizar em sequenciador capilar do tipo "ABI Genetic Analyzer" (310, 3100, 3130, 3500, 3730 ou variantes equivalentes). O protocolo original utiliza POP7 como polímero de separação (alternativamente, poderão ser usados POP6 ou POP4, sempre tendo em atenção as consequentes alterações de mobilidade electroforética).
(Nota: entre as etapas 1 e 2 pode ser efectuado um passo complementar de limpeza do produto de PCR.)
O
perfil electroforético resultante de um processamento adequado da
amostra deverá resultar num electroferograma semelhante ao mostrado na figura.
Aos
laboratórios participantes serão enviados 500 µL de um mix de primers
de PCR para processamento de aproximadamente 500 reacções (mistura já
preparada contendo os pares de primers marcados com fluorescência
necessários para a co-amplificação dos 38 marcadores). Qualquer outro
material ou reagente necessário para a conclusão do estudo deverá ser
obtido pelo laboratório participante.
Para
a publicação dos resultados finais é estabelecido um limite de 1 autor
por laboratório, para um minimo de 100 indivíduos amostrados por
população. Poderão ser aceites até um máximo de 2 autores por
laboratório participante sempre que sejam apresentados dados
correspondentes a pelo menos duas populações compreendendo cada uma
delas pelo menos 100 amostras.
Para
informações adicionais ou esclarecimento de dúvidas sobre o protocolo
da reacção e leitura dos perfis genéticos deverá ser contactado Rui
Pereira (via correio electrónico [email protected]).
A solicitação de ficheiros modelo de "panels" e "bins" para importar no
programa de análise (por exemplo GeneMapper) incluindo suporte para o
seu ajustamento à mobilidade própria de cada aparelho) poderá ser feita
através do mesmo contacto.
As genotipagens obtidas na primeira etapa deverão ser enviadas até 31 de Janeiro de 2013.
Os resultados deverão ser enviados indicando o perfil genotípico das
amostras, acompanhado pela imagem dos electros obtidos em formato pdf.
As genotipagens das populações analisadas na segunda etapa deverão ser reportadas até 31 de Junho de 2013, e enviados em excel de acordo com o modelo disponível.
É
conveniente guardar os arquivos .fsa e/ou os electros relativos a todas
as corridas realizadas uma vez que poderão ser necessários para
esclarecer dúvidas que possam surgir.
Requisitos dos participantes
- A pessoa responsável deverá obrigatóriamente ser sócia do GHEP e ter as quotas em dia.
- O pagamento de uma quota de participação no valor de 150 euros no term estabelecido (online ou por transferência bancária, como descrito em http://www.gep-isfg.org/pt/controle-qualidade/formas-pagamento.html).
Prazos
Data limite de inscrição: 31 de Outubro de 2012
Data limite de pagamento: 30 de Novembro de 2012
Data limite de envio de resultados: 1ª etapa: 31 de Janeiro de 2013
2ª etapa: 30 de Junho de 2013
Contacto
Rui Pereira (IPATIMUP, Porto, Portugal): [email protected]
Referências