Exercício colaborativo GHEP-ISFG “Análise de indels autossómicos informativos de ancestralidade” - AIM-Indels 2014 - 1ª fase
De acordo com a proposta apresentada na última assembleia geral, em 2014 decorrerá a primeira fase do exercício colaborativo GHEP-ISFG “Análise de indels autossómicos informativos de ancestralidade”. Nesta fase será fornecido aos laboratórios participantes o mix de primers necessário para implementar a técnica e realizar a genotipagem das amostras M1, M2 e M3 incluídas no Exercício Intercomparação 2014 (módulo parentesco, nível básico). A implementação adequada da técnica e a genotipagem correcta das amostras da primeira etapa permitirá ao laboratório o acesso à segunda fase* do exercício que será proposta na próxima assembleia geral.
O método de genotipagem das amostras é simples e semelhante ao realizado para STRs, compreendendo uma única PCR multiplex seguida de electroforese capilar (Pereira et al., 2012 ).
O trabalho de laboratório compreende as seguintes fases:
1. PCR multiplex. Amplificam-se os 46 marcadores indel numa única reacção de PCR usando o mix de primers fornecido. O mix de primers encontra-se optimizado para se obter produtos de reacção equilibrados seguindo o protocolo indicado. O protocolo original utiliza a master mix de amplificação “QIAGEN Multiplex PCR Kit”.
2. Separação electroforética dos fragmentos amplificados. A realizar em sequenciador capilar do tipo “ABI Genetic Analyzer” (310, 3100, 3130, 3500, 3730 ou variantes equivalentes). O protocolo original utiliza POP7 como polímero de separação (alternativamente, poderão ser usados POP6 ou POP4, sempre tendo em atenção as consequentes alterações de mobilidade electroforética).
O perfil resultante de um processamento adequado da amostra deverá resultar num electroferograma semelhante ao mostrado na figura. Para referência disponibilizam-se exemplos de electroferogramas das amostras 9947A e 2800M, comummente disponíveis como controlos em kits comerciais.
A título orientativo disponibilizam-se também ficheiros modelo de “panels” e “bins” para importar no programa de análise GeneMapper, sendo no entanto necessário proceder ao seu ajustamento mediante a mobilidade electroforética própria de cada aparelho e tipo de polimero utilizados.
Aos laboratórios participantes serão enviados 100 µL de um mix de primers de PCR para processamento de aproximadamente 100 reacções (mistura já preparada contendo os pares de primers marcados com fluorescência necessários para a co-amplificação dos 46 marcadores). Quaisquer outros materiais ou reagentes necessários para o estudo deverão ser obtidos pelo laboratório participante.
Para informações adicionais ou esclarecimento de dúvidas sobre o protocolo da reacção e leitura dos perfis genéticos deverá ser contactado Rui Pereira (via correio electrónico [email protected]).
Os resultados deverão ser enviados até um mês após a data limite de envio de resultados do Exercício Intercomparação 2014, indicando o perfil das amostras (em formato Excel de acordo com o modelo) acompanhado pelos electroferogramas obtidos em formato pdf.
É conveniente guardar os arquivos .fsa e/ou os electroferogramas relativos a todas as corridas realizadas uma vez que poderão ser necessários para esclarecer dúvidas que possam surgir.
* Nota: na segunda fase do exercício será pedido que cada laboratório caracterize uma ou mais populações de interesse para os 46 AIM-Indels. Para a publicação dos resultados finais será estabelecido um limite de 1 autor por laboratório, para um mínimo de 100 indivíduos amostrados por população. Poderão ser aceites até um máximo de 2 autores por laboratório participante sempre que sejam apresentados dados correspondentes a pelo menos duas populações distintas, compreendendo cada uma delas pelo menos 100 amostras.
Requisitos dos participantes
• Os participantes deverão obrigatóriamente ser membros do GHEP e ter as quotas em dia.
• O pagamento de uma quota de participação no valor de 100 euros no termo estabelecido (online ou por transferência bancária, como descrito em http://www.gep-isfg.org/pt/controle-qualidade/formas-pagamento.html
Prazos
Data limite de inscrição: 31 de Dezembro de 2013
Data limite de pagamento: 7 de Fevereiro de 2014
Data limite de envio de resultados: 12 de Junho de 2014
Contactos
Leonor Gusmão: [email protected]
Rui Pereira: [email protected]