Ejercicio Colaborativo GHEP-ISFG "SPInDel - Identificación taxonómica de muestras forenses"
Genotipaje de muestras
La metodología descrita corresponde a la versión que fue optimizada en nuestro laboratorio.
Las muestras a genotipar corresponden a todas las incluidas en el Ejercicio de Intercomparación 2014 (M1-M8). Se pide a los laboratorios que hayan participado en los tres Ejercicios anteriores, que genotipen también las muestras “no-humanas” de los mismos, concretamente, la M7 de 2011, la M7 de 2012 y la M8 de 2013.
Protocolo PCR SPInDel (v.3) con QIAGEN Multiplex PCR Kit :
Programa PCR (optimizado en termociclador GeneAmp® PCR System 9700 Thermal Cycler):
Post-PCR (electroforesis en ABI 3130 con POP7):
- Size standard LIZ 500; Filtro G5.
Genotipaje
El Genotipaje de las muestras se puede hacer por comparación directa del tamaño de los fragmentos con los controles proporcionados (perfiles de la tabla de abajo), siendo posible realizar el genotipado automáticamente con el Panel y Bins creados en GeneMapper ID v3.2 (descargar aquí ).
Los 10 controles amplificados proporcionados (7µl cada), correspondientes a las 10 especies estudiadas, deberán ser migrados en el equipo que se utilizará para genotipar las muestras de éste ejercicio (0,5µl amplificado en 10µl mix HiDi+LIZ 500; podrá ser necesario diluir los controles, dependiendo del equipo y condiciones de migración).
En caso de pretender realizar el genotipaje automático, deberá importar el Panel y Bins en el programa GeneMapper e los Bins deberán ser ajustados de acuerdo con los tamaños de los fragmentos de los controles obtenidos en su equipo.
La nomenclatura utilizada para designar los alelos no tiene un significado particular (al contrario de los STRs); se recuerda que los fragmentos amplificados corresponden a regiones específicas del DNA mitocondrial (Pereira et al., 2010 ) y para cada marcador genético los alelos se encuentran separados, en su mayoría, por sólo 1 bp.
Ejemplo de un perfil obtenido con SPInDel (v.3):
Análisis de los resultados en el programa SPInDel Workbench
- Descargar el fichero SPInDel Workbench versión 1.3 portable aquí ;
- El fichero está en formato comprimido de archivos zip. Extraiga el fichero utilizando un programa apropiado (por ejemplo, http://www.7-zip.org/ ou www.winzip.com);
- Entre en la carpeta ‘SPInDel_v13_April2014Release’;
- Abra el programa seleccionando el fichero ‘SPInDelv13.exe’;
- En el panel del lado izquierdo encontrará dos proyectos (Fig.1):
GHEP_SPInDel_reference_seqs
GHEP_SPInDel_alleles
El proyecto ‘GHEP_SPInDel_reference_seqs’ incluye el alineamiento de la región de DNA mitocondrial de referencia, donde se localizan los marcadores genéticos para las 10 especies incluidas en el ejercicio. Este proyecto describe la localización de las regiones conservadas donde se anillan los primers incluidos en la multiplex PCR.
El proyecto ‘GHEP_SPInDel_alleles’ incluye la tabla con los alelos para todos los marcadores genéticos de SPInDel. Deberá utilizar este proyecto para analizar las muestras del ejercicio.
- Organice en un fichero (word, excel, u otro) los perfiles obtenidos en las muestras del ejercicio, utilizando los alelos anteriormente descritos. Por ejemplo:
Muestra X: 10 / 14 /10 / 16….
Muestra Y: 16 /12 / 11 / 11…
- En la SPInDel Workbench, seleccione el proyecto ‘GHEP_SPInDel_alleles’ y clique en ‘Calculate Profiles’ (estas instrucciones también se encuentran descritas en el programa) (Fig.2);
- La tabla que aparece en el programa describe los alelos SPInDel para las 10 especies incluidas en el ejercicio (Fig.3);
- Selecciones ‘Search profile’ en el menú del lado izquierdo (Fig.4);
- Añada el nombre de su primera muestra en el espacio indicado (Fig.5);
- Introduzca los alelos de su muestra (ej. 11) en las celdas correspondientes a los marcadores genéticos. En caso de mezclas, separe los alelos del mismo marcador por un punto (ej. 15.16). En el caso de alelos nulos, introduzca un cero (Fig.6).
- Seleccione la muestra con click en su nombre (Fig.7);
- Selecciones ‘Search’ en el menú de la derecha (Fig.8);
- Obtendrá los resultados en la celda del lado superior derecho(Fig.9);
- Añada una nueva muestra, con click en ‘Add’ del lado derecho (Fig.10);
- Introduzca el nombre de la muestra y el perfil, y visualice el resultado como se ha descrito anteriormente;
- Después de añadir todas las muestras del ejercicio, exporte los resultados seleccionando “Export results” (Fig.11);
- Guarde el fichero de resultados (*.xls) con el nombre del investigador responsable del análisis de las muestras en su laboratorio; Por ejemplo: “FilipePereira.xls” (Fig.12);
- Envíe el fichero *.xls de los resultados a [email protected], hasta el día 12 de Junio de 2014.